英文题目：Diagnosing Balamuthia mandrillaris Encephalitis with Metagenomic Deep Sequencing

中文题目：使用宏基因组测序诊断阿米巴原虫脑炎

期刊名：Annals of Neurology    发表时间：2015        IF：9.6 

技术：宏基因组测序

测序平台：Illumina HiSeq2500测序平台(PE135)

材料：一例开始有眼内炎，随后有脑膜炎的74岁女性患者，使用宏基因组测序对其脑脊液（CSF）进行鉴定，以确定感染性病原体。

研究背景:

目前诊断脑膜脑炎病因面临重要的挑战，这是由于各种细菌，病毒，真菌，寄生虫，可以产生重叠的临床表型，常常会延误诊断和治疗。目前许多病原体的特异血清学和聚合酶链反应（PCR）有检测昂贵，费时，并有不易操作等缺点，而宏基因组测序可以发现不常见或新的病毒，因此非常适合用于脑膜脑炎病因的诊断。

病例报告:

病人有过用硫酸羟氯喹治疗类风湿关节炎的病史；没有使用过烟草，酒精，和毒品；在本院治疗前4周，病人曾经在其它3所医疗机构治疗过，每个机构都诊断其有间歇性发热和轻度精神状态改变症状，在第二个医疗机构被诊断为眼内炎，并用万古霉素，头孢他啶和伏立康唑治疗过。

使用PCR对单纯疱疹病毒，巨细胞病毒，弓形体病的玻璃状液检测结果呈阴性。脑磁共振结果显示有很多的环形增强和幕上和幕下病变的扩散受限，被认为符合脓肿以及重度梗阻性脑积水。血液，尿液和脑脊液的细菌和真菌培养结果都是阴性的。脑脊液的神经梅毒，肺结核和隐球菌科的检测结果也是阴性(Table1)。弓形虫病在脑脊液和血清学的检查结果也是阴性。

尽管使用了光谱抗生素，病人的病情恶化，在16天后逐步丧失活动能力和脑干反射能力。在住院的第10天，重复腰椎穿刺显示恶化的细胞增多，同时嗜酸性粒细胞增多症更加突出(Table1)。鉴于这些结果，在住院的第10天停止了广谱抗生素治疗，开始抗结核和抗真菌治疗。第4天的脑活检没有明确的诊断，只揭示了有轻微胶质细胞增生和无炎性细胞或微生物侵入。7天后的第二次脑活检发现了病因不明的严重坏死性血管炎，同时伴随嗜酸性粒细胞，慢性炎性细胞和中性粒细胞的增多，但是没有明显的肉芽肿性成分。在住院的第14天的重复脑磁共振成像显示，病人脑病变的数量和大小明显增多，以及基底性脑膜炎的间隔发展（Fig B，C）。病人日益加重的脑水肿使用高渗性治疗和外部排水变得愈加困难。这个患者的血流动力学最终变得很不稳定，这可能是由于颅内压升高，并要求多个升压药造成的。病人家属最终选择了舒适护理，病人在住院的第17天去世。

表1：传染病诊断试验结果。

研究结果：

在脑脊液中鉴定阿米巴原虫序列

病人样本的宏基因组测序共产生19,642,962 PE reads，大约有5.2G数据。PE reads首先使用PriceSeqFilter进行质量过滤，然后与人类基因组hg19进行比对，没有比对上人类基因组hg19有33,093条reads，占原始数据的0.1%。然后通过和NCBI的核苷酸数据库比对确定潜在的病原体，结果发现97%的序列比对上脊椎动物序列和已知的实验室污染物序列。

过滤完后，发现阿米巴原虫是丰度最高的物种，其中81个reads比对上NCBI上3个已知的阿米巴原虫基因。而一个水对照样本则没有发现可以比对上阿米巴原虫的序列。使用比对上阿米巴原虫基因序列的30个reads进行组装，最终生成一个806nt的contig，这个contig能比对上阿米巴原虫的16S核糖体基因(GenBank accession number KP990616)。

对宏基因组测序结果进行验证

使用各种方法验证了阿米巴原虫的存在。使用PCR在甲醛固定的第二次脑活检组织、脑脊液、受感染的眼睛玻璃体液鉴定到了阿米巴原虫的18s核糖体基因。使用病人第二次脑活检组织更多切片进行重新评估，发现的微生物与血管内的阿米巴原虫相同，并且阿米巴原虫已经延伸到神经组织(Fig D)。在疾病预防控制中心传染病病理科对脑活检组织中的阿米巴原虫进行免疫组化检测(Fig E)，发现了大量活的阿米巴原虫滋养体。使用血清学方法对脑活检组织中的阿米巴原虫检测发现结果呈阳性(Table1)。

图1：神经影像学和神经病理学。（A）轴向T2加权/液体衰减反转恢复序列（FLAIR）脑磁共振成像（MRI）显示多个高信号（箭头），分别对应扩散加权成像上的受限扩散区域。（B）轴向T2加权/液体衰减反转恢复序列（FLAIR）脑磁共振成像（MRI）显示多个高信号的大小和数目。（C）增强轴位T1加权MRI显示多个环形强化病变（白色箭头），基底脑膜炎（黄色箭头）以及重度脑积水。（D）脑实质过碘酸-希夫染色切片显示了坏死性血管炎，慢性炎性细胞，和大量类似巨噬细胞的阿米巴滋养体（箭头）；大多数的组织显示一个强烈伴随混合性炎症的坏死性血管炎伴，包含了大量巨噬细胞和嗜酸性粒细胞。（E）免疫组织化学显示了大量活的阿米巴原虫滋养体。

结果总结：

通过宏基因组测序在脑脊液中鉴定到能比对上阿米巴原虫核糖体RNA基因的序列。随后的PCR反应确认了阿米巴原虫在脑脊液、脑组织和受感染的眼睛玻璃体液中的存在。血清学和免疫组化对脑活检组织中阿米巴原虫的检测也呈阳性。因此宏基因组测序是一个功能强大的诊断工具，能够快速鉴定病原菌，从而为早期靶向治疗提供帮助。

文章亮点：

本文患者对血液，尿液和脑脊液通过许多病原体的特异血清学和PCR检测结果均呈阴性，而通过宏基因组测序在脑脊液中则鉴定阿米巴原虫，这个结果通过其它方法检测也得到了验证，说明宏基因组测序因为可以发现不常见或新的菌种，因此在脑膜脑炎病因诊断方面有无可比拟的优势。