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ChIP-seq

ChIP-seq技术介绍
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技术简介：
      染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力方法，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。
         ChIP-seq的原理是首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。

应用领域：
  •        •  反式因子在基因组上结合位点的精确定位
  •         •  组蛋白共价修饰与基因表达的关系

技术优势：
  •         •  全基因组覆盖：ChIP-Seq可在全基因组范围单碱基水平对蛋白结合位点进 行筛选与鉴定。
  •         •  高灵敏度：每个样本可获得数百万条的序列标签，可发现研究基因组上稀有的蛋白结合位点。
  •         •  高精确率：可获得高水平的信噪比数据，准确区分真实事件与噪音，精确定位蛋白结合位点。
  •          高性价比：仅需较少的数据量即可鉴定全基因组范围内的结合位点。
技术参数与实验流程
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技术参数
样本要求 测序策略 数据要求
  • 样品类型：ChIP富集好的DNA样品；
  • 组织类型：不限 ；
  • 物种信息：不限 （有基因组参考序列） ；
  • 抗体类型：不限（需提供ChIP阳性位点或所用抗体的信息，用于样品质检和测序数据分析。）
  • 样本保存和运输要求：-20°C保存，冰袋运输；
  • 样品总量：单次实验≥200 ng，请尽可能提供两次以上的用量；
  • 样品浓度：≥10 ng/µL；
  • 样品纯度：OD260/OD280 = 1.8-2.2；
  • DNA片段大小：分布在100-500 bp，主峰分布在200-300 bp；
  • 建议提供ChIP获得DNA设计引物进行qPCR定量的检测报告，附阳性和阴性对照的结果。
 Hiseq 2*150
  • 常规深度：6G clean data；高深度：10G clean data

 

实验流程

A.    ChIP-seq建库测序流程


B.     数据分析流程

经典文章解读
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案例：利用ChIP-seq鉴定番茄转录因子ASR1结合位点


背景：
  •          确定转录因子的靶基因对于揭开所有类型生物的调控网络是特别重要的。Asr1，这个转录因子是植物独有的，并且广泛共知它在减轻因为水的缺乏而引起的干旱胁迫方面是起着非常重要的作用。尽管Asr1已经被克隆出20多年，但是其靶基因仍然是不清楚的。

方法：
  •          研究人员采集干旱胁迫处理过的番茄叶片（WT），利用Anti-ASR1 抗体进行 ChIP-seq；比对参考基因组，peak calling ；qPCR验证 转录因子识别位点是否准确 ；然后对Peak关联基因在基因组上的位置进行分析； 对Peak关联基因进行GO分析；并进行ASR1-binding motif预测。

结果：
  •         •  通过ASR1抗体富集到5个显著的peak区域(3–830, 9–950, 10–800, 10–810 and 10–820) 。
  •         •  用qPCR验证了转录因子识别位点是准确的，并使用ST-3作为负对照。
  •         •  ASR1结合区域在基因组上的分布发现42%的结合区域位于上游调控区，45%位于编码区和内含子区，而13%位于下游区域。
  •         •  对ASR1富集的靶基因进行细胞功能分类，发现ASR1富集的靶基因参与编码细胞壁的合成和重建以及一些水通道蛋白 。
  •         •  确定了一个ASR1-binding DNA motif。
  •         •  在Asr1-silenced转基因植物中检测ASR1作用位点（3-200，10-820）的表达，结果发现当ASR1被RNAi后，其靶基因的表达显著降低，表明靶基因直接受ASR1调控 。

参考文献
Ricardi MM., et al., Genome-wide data (ChIP-seq) enabled identification of cell wall-related and aquaporin genes as targets of tomato ASR1, a drought stress-responsive transcription factor. BMC Plant Biology, 2014 Jan 14;14:29.
 

 

 
图一：通过ASR1抗体富集到的peak区域，并用qPCR验证转录因子识别位点是否准确

图二：ASR1结合的基因组区域分析

图三：确定了一个ASR1-binding DNA motif

图四：靶基因的表达直接受ASR1调控

 
 

     
     
  
 
 
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