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英文题目：Bovine NK-lysin: Copy number variation and functional diversification 期刊名：PNAS 影响因子：9.674 研究背景： 抗菌肽（AMP）是先天免疫系统的效应分子，它在整个生命周期都广泛存在。人粒溶素（GNLY）和猪NK-lysin是同源基因，都属于抗菌肽（AMP），它们在抵抗多种微生物，包括革兰氏阳性和阴性细菌，真菌，原虫，病毒，甚至肿瘤细胞都是非常有效的。NK-lysin的同源基因已经在许多物种中被鉴定到，包括人，猪，牛，马和几种鸟类。在人类及其它大多数哺乳动物中，NK-lysin是单基因，而牛的NK-lysin是十几年前第一个被报道的，当时从四种不同奶牛中发现了两个NK-lysin cDNA片段（Bo-lysin 89和Bo-lysin 62），但是目前还不清楚这两个片段是来自两个不同的NK-lysin基因还是来自同一个NK-lysin基因的等位基因。 拷贝数变异（CNV）是一种常见的动物基因组结构变异。过去已经针对不同品种的牛进行了全基因组CNV分析，其中两个研究表明，牛NK-lysin基因处于一个CNV区域。高度一致（90%）的重复（> 1 Kb）被称为“片段复制”，片段复制在哺乳动物基因组中是非常常见的，它是基因家族扩张的主要机制之一。奶牛基因组测序显示和人及小鼠一样奶牛中的许多免疫相关基因拷贝数也得到扩张，这其中就包括抗菌肽，β-防御素，C型溶菌酶和脂多糖结合蛋白，这些基因家族的扩张可能会产生新的功能基因，从而影响反刍动物胃中的独特生理或群体环境中的疾病抵抗能力。 研究材料： 4头荷斯坦牛；CHORI-240 Bovine BAC文库；5个组织（肺、胸腺、脾脏、呼吸淋巴结、肠淋巴结） 技术平台： PacBio RS三代测序，一代测序，qPCR，抑菌实验 研究思路： 通过NCBI数据库鉴定到7个不同NK-lysin序列； 系统发育分析把它们分为4个不同的NK-lysin基因； 克隆测序验证NK2A, NK2B, NK2C是否真实存在； BAC克隆重测序鉴定牛科4个NK-Lysin基因； 鉴定NK-Lysin家族基因组结构和CNV断点； 一代测序验证本次得到的 Bo-NK contig精确性； 牛科NK-Lysin家族的遗传结构分析； 牛科NK-Lysin家族的重复序列分析； qPCR检测牛科NK-Lysin基因在不同组织中的表达； 牛科NK-Lysin多肽的抗菌效果； 研究结果： 牛科NK-lysin纯合性分析 通过寻找NCBI脱氧核苷酸数据库鉴定到7个不同NK-lysin序列，序列的系统发育分析可以把它们分为4个分支，分别代表4个不同的NK-lysin基因（NK1, NK2A, NK2B, NK2C）（Fig. S1），其中NK1, NK2A, NK2B彼此密切相关，而与NK1有显著不同。 
Fig. S1. 7个不同NK-lysin序列的系统发育分析
其中NK1 和 NK2A在牛科参考基因组UMD 3.1中分别被注释为uncharacterized LOC616323和 Bovine GNLY，这两个基因在11号染色体上串联排列。而NK2B, NK2C在牛参考基因组中是不存在的。为了确认NK2A, NK2B, NK2C的真实性，针对这几个基因的保守区设计引物，为了减少等位基因变异在分析中的影响，基于770K HD SNP芯片分型结果选择了NK-lysin区域及侧翼两个基因（ATOH8和SFTPB）是纯合子的4头荷斯坦牛（2527, 2796, 2822, 3850）用于下一步的分析。结果从这4个个体中共得到5个不同的序列（Fig. 1），这5个序列形成3个分支，分别对应NK2A，NK2B，NK2C。这3个分支与NK1有明显的不同。在个体2527中检测到NK2A的两条序列，如果个体2527在NK-lysin区域是纯合的，那么在牛中NK2A至少存在两个拷贝。在个体2822和3850中没有发现NK2B相关克隆，并且使用NK2B特异基因引物不能得到其扩增子，说明在这两个个体中不存在NK2B。
Fig. 1. 在4个纯合个体（2527, 2796, 2822, 3850）中进行NK2A, NK2B, NK2C序列分析。对牛的NK-lysin 参考序列（NK1, NK2A, NK2B, NK2C），猪同源序列（Horse-NKL），马同源序列（Horse-NKL）和来源于4个个体的5个不同克隆序列（Seq. 1–5）进行系统进化分析。
BAC克隆测序鉴定4个NK-Lysin基因通过对覆盖NK-Lysin区域的两个重叠BAC克隆进行测序来确定牛科NK-Lysin家族的精确基因数目和基因组构成，这两个BAC克隆分离于CHORI-240 Bovine BAC文库，然后使用PacBio RS进行测序。通过两轮测序，平均覆盖深度达到1310-1551×，因为这两个文库有重叠，所以对序列进行了de novo组装，得到两个contig，这两个contig有2 kb的完全重叠区域。然后这两个contig被组装成一个长度227,063 bp，覆盖整个NK-Lysin区域的supercontig。这个组装结果（Bo-NK）要比目前牛基因组189,124 bp （Bos_taurus_UMD_3.1）的组装结果长了38 kb，而这个长度上的区别主要由参考基因组的错误组装引起的。 鉴定NK-Lysin家族基因组结构和CNV断点 针对本次得到的Bo-NK supercontig 进行散点图分析，结果发现了3个具有95%相似性的片段复制（SD-NK2A；SD-NK2B；SD-NK2C），每一个片段复制都包含一个NK-lysin基因，NK1位于NK2C下游41.8 kb ，并且SD-NK2C长度要比SD-NK2A 和 SD-NK2B短，（Fig. 2B）。连接点4（JP-4）序列和其它三个连接点（JP-1，JP-2，JP-3）相比有所不同（Fig. 2C）。 
Fig. 2. PacBio 对BAC 克隆的测序分析。（A） 本次得到的Bo-NK supercontig序列和原来基因组序列 （Bos_taur-us_UMD_3.1.1）的比较结果。错配 （垂直的蓝线）；内部重复（灰盒）；4个NK-lysin 基因位置 （箭头） 。（B） 针对本次得到的 Bo-NK supercontig 进行散点图分析 。（C）NK-Lysin家族的基因组结构和鉴定到的断点。JP-2的侧翼序列作为参考序列。
一代测序验证本次得到的 Bo-NK contig精确性为了确定本次得到的Bo-NK contig精确性，在每个连接点（JP）设计引物进行验证（以CHORI-240 Bovine BAC文库的供体DNA作为模板），一代测序后发现JP-1，JP-3，JP-4 的PCR产物与三代测序得到的Bo-NK contig完美一致。 NK-Lysin家族的遗传结构分析 通过对这4个NK-Lysin的基因组序列进行比对来确定其遗传结构（Fig.S2）。结果发现这4个NK-Lysin基因都包含5个外显子，并且这些外显子的大小相差不多，但是NK1的内含子要大于其它3个基因的内含子。NK2A，NK2B，NK2C 相互之间有95%相似性，但是与NK1只有85% 的相似性。通过对这4个NK-Lysin以及人类、猪、马、羊同源基因编码序列的系统发育分析，发现只在反刍动物存在NK-Lysin基因家族的扩张。 
Fig. S2. 4个NK-Lysin基因组序列的比对
牛NK-Lysin基因家族的重复序列分析在人类基因家组中，重复序列经常是与重组热点是关联的，另外与断点处重复序列错配引起的染色体不稳定也是相关的。深入分析了NK-Lysin区域内重复元件的分布（Fig. 3A）。总体来说每个断点处下游区域要比上游区域具有更多的重复，NK1的侧翼序列重复度更高，它包含一个大的长的，分散的细胞核元件（LINES），这与其它3个基因有明显不同。数个重复家族位于NK-Lysin区域内，包括2个L1家族，2个LTR家族，4个牛科特异的，短的，分散的细胞核元件（SINE）家族（BOVTA，BTALUL2，CHR-2_BT，CHR-2A）。接着绘制了每个断点处上游或下游5 kb内牛科重复家族的分布图（Fig. 3B）。JP-1，JP-2，JP-3 下游临近区域富集了SINES，特别是BOVTA元件。BOVTA元件组成了一个牛科特异重复家族，这与人类片段复制相关的ALU重复家族非常类似，表明片段侧翼的断点具有很高的同源性，这有助于减数分裂时的不平等交换和牛科NK-Lysin基因家族结构的不稳定性。 
Fig. 3. 重复元件分析。（A）组装好的supercontig Bo-NK内重复元件的分布，四个断点和基因如图所示。（B） 每个断点处上游或下游5 kb内SINEs的分布图。
牛科NK-Lysin基因的组织特异性表达为了检测牛科NK-Lysin基因是否都表达，分别在5个组织（肺、胸腺、脾脏、呼吸淋巴结、肠淋巴结）中检测了这些基因的表达量。qPCR结果发现这4个NK-Lysin基因都表达，但是每个基因表达都表现出组织特异性（Fig. 4）：NK1 和NK2A在肠淋巴结高表达但是在肺中低表达；NK2B在各组织中都表达，但在肠淋巴结和肺中高表达；NK2C则在肺中表达量最高。 
Fig. 4. NK-Lysin在肺（L）、胸腺（T）、脾脏（S）、呼吸淋巴结（RLN）、肠淋巴结（IPP）中的基因表达。
牛科NK-Lysin多肽的抗菌效果使用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌对4种NK-Lysin多肽的抗菌效果进行了测试，这4种NK-Lysin多肽在纳摩尔浓度对这两种菌株的抑菌效果都是有效的（Fig. 5A）。接着使用透射电镜观察了NK-Lysin多肽对大肠杆菌细胞膜的作用效果（Fig. 5B），结果发现没有经过NK-Lysin多肽处理的细胞呈现完整的细胞形态，例如保持一个完整的细胞膜和充足的细胞质；而经过NK-Lysin多肽处理的细胞则呈现周质空间膨胀和细胞质收缩，这表明这4种牛科NK-Lysin多肽具有明显的抗菌效果。  
Fig. 5. （A） 4种NK-Lysin多肽对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌的抗菌效果。（B） 透射电镜观察NK-Lysin多肽对大肠杆菌细胞的作用效果，（a） 对照细胞；（b）5 μM NK-Lysin多肽处理20分钟后的细胞。
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